Agnolo Gaddi, né à Florence dans une famille de peintres, poursuit une longue tradition artistique familiaire qui a duré plusieurs générations . Son père, Taddeo Gaddi (1300-1366), était peintre et architecte et son grand-père, Gaddo Gaddi, était artiste, lui-aussi. Quoique deux génerations le séparent de Giotto, le maître de son père Taddeo, Agnolo Gaddi est encore influencé d'une manière importante par le style de l'artiste florentin qui est considéré le précurseur de la Renaissance en peinture.
Agnolo Gaddi commença à travailler à Rome, à des fresques qu'il réalisa en collaboration de son frère, Giovanni. Les peintures furent exécutées pour le Vatican à l'époque de Urbain V. Son œuvre la plus célèbre est certainement la décoration de la chapelle majeure de Santa Croce, où il peignit la Légende de la Véritable Croix, en contribuant également à la réalisation des vitraux de la même chapelle. À Santa Croce il y a d' autres témoignages de son œuvre, dans la chapelle Castellani, aussi bien que d'autres grands artistes du XIVe siècle, tels que Giotto et Taddeo Gaddi.
Parmi les peintures à tempera destinées aux autels des églises, on rappelera la Vierge à l'Enfant en trône avec saints et le Couronnement de la Vierge, pour l'église San Giovanni dei Fieri près de Pise. Il s'agit de deux œuvres dont l'exécution a engagé l'artiste pendant dix ans. Vers la fin de sa vie il acheva une de ses peintures parmi les plus connues, la Madone de l'Umiltà avec six anges, et une Crucifixion, un de ses derniers travaux.
Son activité de sculpteur est témoignée par les médaillons de la Loggia de la Signoria. Entre 1383 et 1386, il exécuta les panneaux en pierre qui symbolisent les vertues cardinales et qui se trouvent sur la façade de la Loggia, vers la place de la Signoria.
Peu avant sa mort, en 1396, Agnolo peignit une série de scènes où il figurait la vie de la Vierge, dans la cathédrale de Prato. Sa dernière œuvre, inachevée, était un retable pour l'autel du Crucifix de San Miniato al Monte à Florence. Vasari a inséré la vie de Agnolo Gaddi dans ses biographies d'artistes, en contribuant ainsi à sa renommée.