Nacido en Florencia en una familia de pintores, Agnolo Gaddi continuó la línea artística de familia, después de su padre Taddeo Gaddi (1300-1366), pintor y arquitecto, y su abuelo Gaddo Gaddi, que era también un artista. Agnolo Gaddi es conocido por ser el último gran artista florentino estilísticamente influenciado por el maestro de su padre, Giotto di Bondone (1267-1337). Más conocido simplemente como Giotto, Bondone era un maestro de la pintura, considerado como el fundador del Renacimiento italiano.
Agnolo Gaddi tuvo su primer trabajo en Roma, para un ciclo de frescos en el que trabajó con su hermano Giovanni, también pintor. Los frescos fueron realizados para el Vaticano, bajo el papa Urbano V. Pronto llegó la que probablemente es su obra más conocida, la serie de frescos para la basílica de Santa Croce en Florencia, la Leyenda de la Verdadera Cruz. Los frescos de Gaddi se encuentran en la Capilla Baroncelli y en el presbiterio, pero él pintó también las ventanas de este último. En Santa Croce hay trabajos tanto del padre de Taddeo, como de Giotto.
Posteriormente Gaddi pintó la Virgen con el Niño y Santos, empezada en 1380 y terminada diez años después. Otra obra completada dentro de diez años es la Coronación de la Virgen. Aunque no está confirmado, parece que la obra fue el panel central de un retablo para la iglesia de San Giovanni dei Fieri, fuera de Pisa. Llevando adelante su inspiración religiosa, en los años Noventa del siglo XIV, completó otra obra muy conocida, la Virgen de la Humildad con seis ángeles y uno de sus últimos trabajos, un Crucifijo.
Además de las pinturas realizadas al temple, Gaddi realizó también los medallones, o paneles, para la Loggia dei Lanzi, que todavía se encuentra cerca de la Galería de los Uffizi. Entre 1383 y 1386 completó los paneles, que simbolizan las cuatro virtudes cardinales y se encuentran en la parte frontal de la Loggia, justo por debajo del parapeto.
Antes de su muerte, en 1396, Gaddi pintó una serie de escenas de la vida de la Virgen Maria, en la catedral de Prato. Su última obra, inconclusa, era para un altare de San Miniato al Monte, en Florencia. El artista e historiador Giorgio Vasari puso la vida de Gaddi entre sus biografías de los artistas.