Hans Holbein el Joven aprendió a pintar de su padre, Hans el Viejo (1460-1524), contribuyendo, al igual que su padre, al tránsito del arte alemán del Gótico al Renacimiento. Era el hermano menor de Ambrosius Holbein (1492-1519), él también pintor. Hans el Joven es históricamente conocido por su importante contribución, las ilustraciones para las sátiras del humanista Erasmo de Rotterdam (1466-1536), su Elogio de la locura. Uno de los más famosos retratos de Erasmus fue creado por Holbein. Realizó ilustraciones también para la histórica traducción de la Biblia de Martín Lutero.
Estas ilustraciones, aunque magistrales, compiten con los 41 dibujos utilizados para las xilografías de la Danza de la Muerte. Holbein realizó el trabajo para un libro publicado en 1538, representando alegorías medievales. Estas primeras obras fueron pintadas mientras el artista estaba en Basilea, Suiza. El movimiento de la Reforma Protestante no creó una situación muy provechosa para los artistas en Basilea, fomentando la salida de Holbein para Inglaterra, en 1526. Allí encontró el apoyo de la corte de Enrique VIII (1491-1547), e hizo retratos, entre otros, del rey, y de la reina Ana Bolena (1501-1536) y de la tercera esposa del rey, Jane Seymour (1507-1537).
Muchos de los retratos de la corte de este período crearon debates y confusión en cuanto a quiénes eran los sujetos. También pasó con el retrato ahora en los Uffizi, que se cree representa a Thomas More, estadista Inglés que Holbein conoció por Erasmo. El retratista realizó también otra pintura representante More, poco después de su llegada a Inglaterra, alrededor de 1527. Otro retrato completado en su período en Londres también está en los Uffizi, el Retrato de Sir Richard Southwell. Uno de sus retratos más elogiados por la corte es Embajadores, con el famoso cráneo anamórfico en la base de la pintura. Aunque los críticos han identificado varios personajes de la corte como modelos de la imagen, no hay duda de que el trabajo es magistral en la representación de los hombres y de los objetos de contexto.
En los Uffizi hay también uno de sus autorretratos. Para realizar sus retratos él dibujaba a lápiz antes de pintar a sus sujetos, y estos dibujos son considerados obras de arte en sí mismas. Su último trabajo fue un retrato incompleto del rey Enrique, comenzado mientras se encontraba en Londres. Holbein nos ha dejado también obras religiosas, incluyendo el altar Oberried y el retablo de la Pasión.