A pesar de que trabajó en Florencia, Ambrogio Lorenzetti es conocido entre los pintores de la escuela de Siena. Esta escuela de pintura, tenía un estilo elegante, reconocido en ese tiempo también por sus rivales, incluso por los pintores florentinos entre los siglos XIII y XV.
El trabajo de Lorenzetti sobrevive con una pintura del 1328 que contiene la primera documentación de la existencia de la clepsidra. Él contribuyó también a una obra de importancia histórica, Alegoría y efectos del Bueno y Malo Gobierno, una enciclopedia de la pintura que muestra una campaña idealizada y un pueblo medieval. Esta obra presenta un estilo similar a lo de los frescos realizados por Lorenzetti en las paredes de la Sala de los Nueve, o Sala de la Paz, en el Palacio Público de Siena. Son obras importantes para la reconstrucción de la historia de Siena, y muestran un artista políticamente sagaz y un buen observador moral.
Estos frescos, que datan 1337-1339, son representaciones mundanas de figuras alegóricas de la virtud que guía el gobierno de la república. A los lados de los Efectos del Buen Gobierno en la Ciudad y en campaña, hay otras tres pinturas, menos conservadas, Alegoría del Buen Gobierno, Alegoría del Malo Gobierno y Efectos del Malo Gobierno en la Ciudad y en campaña. Son obras complejas, panorámicas que revelan la influencia gótica de otros pintores de Siena, como Simone Martini (1284-1344).
Sin embargo, la obra de Lorenzetti muestra un estilo más naturalista que lo de Martini o de otro artista sienés, Duccio. El artista también recibió la influencia de su hermano, el pintor Pietro Lorenzetti (1280-1348). Los hermanos Lorenzetti se consideran los responsables de la introducción de esto estilo naturalista en la escuela de Siena. A través de su hermano, la influencia de Ambrogio se puede encontrar también en la de Giotto.
Muy pocas obras de Lorenzetti han llegado hasta nosotros y su primer trabajo conocido es la Virgen con el Niño, realizada en 1319. Sus otras obras, además de los frescos en la Sala de los Nueve, incluyen un fresco en San Francesco, titulado La investidura de san Ludovico de Tolosa (1329), un retablo en San Procolo de 1332, titulado Virgen con el Niño entre los santos Nicola y Procolo, otro fresco en San Francesco, el Martirio de los Franciscanos (1336), y un retablo de Santa Petronilla, comisionado para el altar de San Crescenzo en la catedral de Siena, en 1342.
A menudo se dice que el estilo de la obra de Lorenzetti ha anticipado el Renacimiento italiano. En ese tiempo, una epidemia de peste bubónica devastó la región y se supone que los dos hermanos Lorenzetti han muerto por esta enfermedad.